破译诊断密码：长读长测序，点亮临床精准诊断新未来

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破译诊断密码：长读长测序，点亮临床精准诊断新未来

诊断困境呼唤技术革新

在现代医学实践中，仍有相当一部分遗传病患者及其家庭深陷漫长的诊断困境，历经多轮检测仍无法明确病因。传统的二代测序（NGS），虽在成本和通量上占据优势，但其短读长的固有局限性，在面对基因组的复杂“角落”——如结构变异（SVs）、串联重复序列异常扩增、复杂单倍型时，往往难以提供完整且准确的答案，导致诊断瓶颈。

长读长测序：精准诊断的新曙光

此时，以PacBio HiFi和Oxford Nanopore为代表的三代长读长测序（TGS）技术，凭借其直接读取长片段DNA/RNA的独特能力，正逐渐从科研前沿走向临床视野。其价值在T2T联盟完成首个人类完整基因组图谱（《Science》，2022）的过程中得到充分印证，并被《Nature Methods》评为年度技术方法，正是因为它“赋能更全面完整基因组信息的获取与解读”。长读长技术，正为攻克临床诊断难题带来新的曙光。

核心优势：超越短读长，洞悉基因组复杂性

长读长测序的核心优势在于解决了NGS面临的关键挑战，可概括为“序列完整，信息全面”：

全面的结构变异（SV）检测

人类基因组差异的很大一部分源于结构变异，如大片段的插入缺失、倒位易位。对于NGS而言，准确鉴定这些变异极具挑战性。 而TGS的长读长能完整跨越复杂SV的两端断裂点及内部序列，实现全基因组范围内的高精度SV检测，极大提升了对致病性结构变异的发现能力。同时，在那些NGS难以比对（mapping）或存在片段重复的区域，TGS也能明显改善单核苷酸变异（SNV）和短插入缺失（Indel）的检测准确性。

准确的重复序列区域分析

对于由短串联重复序列（STR）异常扩增引起的疾病（如亨廷顿病、脆性X综合征、C9orf72相关ALS/FTD），TGS能直接测通整个重复区，精确量化重复数，提供金标准级的诊断依据。

脆性 X 综合征

脆性 X 综合征

DMD基因突变

DMD基因突变

精准的单倍型定相与假基因辨识

TGS能够物理连接同一条染色体上的多个变异位点，直接“还原”单倍型，从而精确判断复合杂合突变的致病性、确定隐性遗传病的遗传模式。此外，长读长还能有效区分功能基因与其高度相似但无功能的假基因（如CYP2D6与其假基因），避免因错误比对导致的假阳性或假阴性诊断结果，这对临床诊断至关重要。

全面的转录本信息

在转录组层面，TGS能直接获得全长转录本-异构体（isoform）的完整结构，无需计算组装。这使得在转录本水平上对于可变剪切、融合基因、Poly(A)尾长度的研究更加精细准确。例如，在肿瘤研究中，精确鉴定致癌融合基因的全长结构对于理解其功能和指导靶向治疗意义重大。

表观遗传信息的同步获取

除了DNA序列，某些TGS技术（如PacBio HiFi测序检测5mC，ONT直接测序检测DNA/RNA修饰如5mC、m6A等）还能在测序过程中同步检测核酸上的天然化学修饰。这为探索表观遗传异常在疾病（包括遗传病和肿瘤）发生发展中的作用开辟了新途径，可能发现与疾病相关的表观遗传信号，解释新的调控机制。ONT平台的RNA直接测序技术更是保留了RNA的天然单碱基修饰（如m5C, m6A），开启了RNA表观遗传学（Epitranscriptomics）在临床研究中的潜力探索。

热门应用聚焦：长读长技术赋能临床决策

基于这些优势，长读长测序已在多个临床领域展现出巨大潜力并积累了令人信服的案例：

罕见病与未诊断疾病

TGS已成为该领域的重要诊断利器。其卓越的SV检测能力使得研究者能够发现被WES/WGS（基于NGS）漏检的致病性结构变异，正如美国斯坦福大学医学院报道的案例，通过长读长测序成功为多例长期未确诊患者找到了复杂SV病因。

长读长测序在未确诊罕见病中优于短读长的效用总结

长读长测序在未确诊罕见病中优于短读长的效用总结

准确的单倍型定相和假基因辨识能力也避免了潜在的诊断错误。美国NIH的未诊断疾病网络（UDN）的广泛应用进一步证明了其在终结许多家庭漫长的求诊之路上的关键作用。

单一LRS检测替代多步骤复杂临床检测

单一LRS检测替代多步骤复杂临床检测

神经与肌肉遗传病

这类疾病常涉及重复序列异常和复杂SV。利用ONT或PacBio技术，能够精确量化C9orf72基因六核苷酸重复扩增次数，明确诊断ALS/FTD。对于脆性X综合征（FMR1基因CGG重复）、肌强直性营养不良（DMPK基因CTG重复）等，TGS同样提供了超越传统方法的诊断精度。

药物基因组学（PGx）

关键药物代谢酶基因（如CYP2D6）结构复杂。TGS通过精确的单倍型定相和区分功能基因与假基因的能力，为临床提供更可靠的个体化用药指导。例如，美国CDC的GeT-RM项目及梅奥诊所等机构利用长读长测序（如PacBio HiFi）完整解析CYP2D6单倍型，避免了基于NGS的错误分型。

CYP2D6基因正确分型

CYP2D6基因正确分型

肿瘤基因组学

TGS在解析复杂肿瘤基因组重排、发现新融合基因方面价值凸显。此外，通过全长转录本测序，可以更准确地鉴定驱动肿瘤发生的融合基因及其异构体，为靶向治疗提供更精细的信息。其同步检测表观修饰的能力也为理解肿瘤发生发展的表观遗传机制提供了新视角。例如，在BRCA1/2基因突变检测中（与乳腺癌和卵巢癌风险相关），三代测序能够识别二代测序可能遗漏的复杂变异。并且，乳腺癌、妇科肿瘤和泌尿肿瘤的靶向Panel检测产品已经基于三代测序技术开发完成，能够实现单碱基分辨率的精准检测，为肿瘤的靶向治疗和个体化治疗提供重要依据。

图为浙江清华长三角研究院使用泌尿肿瘤三代测序靶向Panel首次发现了LRP1B的结构变异，LRP1B抑癌基因的缺失变异，属于大片段E4~E6（外显区域）缺失，突变比例高达VAF=20%。

LRP1B的结构变异

LRP1B的结构变异

感染性疾病诊断

TGS能够快速获得病原体的全长16S rRNA序列（用于细菌/真菌鉴定）或完整的病毒/细菌基因组，实现菌种乃至菌株水平的精确鉴定。其长读长特性对于获得微生物完整基因组和进行群体功能的精细化注释提供了天然技术优势，有助于快速确定病原体、检测耐药基因和毒力因子，指导临床抗感染治疗。

产前诊断

在无创产前检测（NIPT）中，三代测序通过分析孕妇血液中的胎儿DNA，显著提高了检测胎儿染色体异常和单基因病的准确性和灵敏度，为孕期健康管理提供了更可靠的支持。例如，常染色体显性多囊肾病 (Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease， ADPKD) 是一种常见遗传性肾病，该病以常染色体显性方式遗传，子代发病率为50％。ADPKD 的两个主要致病基因是 PKD1 和 PKD2，三代测序能够全面覆盖PKD1和PKD2基因的所有外显子，准确揭示PKD1和假基因之间罕见的序列差异，确保检测结果的真实性和可靠性。

ADPKD致病机制

ADPKD致病机制

从科研到临床：挑战与机遇并存

尽管前景广阔，长读长测序在临床的常规化应用仍面临一些挑战：成本相对较高（虽然正在快速下降）、数据分析流程和解读标准的规范化、大规模临床验证研究的需求等。然而，随着PacBio Revio和ONT PromethION等高通量平台的推出，测序成本大幅降低，准确性持续提升；同时，相关的生物信息学工具和数据库也在不断完善。越来越多的研究证据和临床实践案例正在证实其临床价值。

未来展望：长读长测序，精准诊断的新基石

可以预见，未来几年内，长读长测序将不再仅仅是科研探索的工具或疑难病例的“最后手段”。随着技术的成熟和成本的进一步优化，它有望被更广泛地纳入临床诊断路径，可能作为特定疾病类型的一线检测，或在NGS检测阴性/结果不明确时作为标准的二线检测。

这不仅将极大提升遗传病、肿瘤等复杂疾病的诊断水平，也将推动个体化医疗进入更精准的阶段。对于临床医生和生物信息学分析人员而言，理解并掌握长读长测序技术的原理、应用场景及其数据分析解读，将成为未来不可或缺的核心能力。

拥抱变革：提升您的长读长分析实战技能

认识到长读长测序在临床诊断领域的巨大潜力是重要的第一步。然而，要将这一强大技术真正转化为临床实践中的诊断能力，深入掌握其数据分析流程、解读策略以及与临床表型的关联是关键所在。

为了帮助大家紧跟技术前沿，从理论认知走向实战应用，天意生信云平台特别推出了一系列关于三代测序技术的全方位实战培训内容。该系列课程由山东第一医科大学博士，三代测序技术先行者--李冕老师主讲，将系统性地覆盖从实验设计考量、数据质控、比对分析到变异检测（特别是SV和重复序列分析）、单倍型定相、临床意义解读等核心环节，结合真实案例，提供规范性的操作指导和针对性的答疑解惑。

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